重要小贴士
“第8期中药复方网络药理学培训会议（基础班）”将于年8月23-25日在北京召开，本次培训会将邀请长期从事网络药理学的研究人员，将结合个人实践经验，从科研设计、项目具体实施以及SCI文章发表等多个方面，通过实际案例，与广大学员共同学习探讨网络药理学在中药作用原理研究中的思路及方法。了解培训详细信息及报名直接点击文章最下方阅读原文。
牡丹皮药材商品规格等级标准及质量评价
邓爱平1，方文韬1，2，谢冬梅2，
张悦1，3，方成武2，康传志1，
吕朝耕1，岳媛4，康利平1，
南铁贵1，赵玉洋1，郭兰萍1通信作者，詹志来1通信作者
(1.中国中医科学院中药资源中心道地药材国家重点实验室培育基地，北京；2.安徽中医药大学药学院，安徽合肥；3.河南中医药大学药学院，河南郑州；4.重庆市中药研究院，重庆)
牡丹皮为毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，用药历史悠久，具有很高的药用价值。其味苦、辛，微寒，归心、肝、肾经，有清热凉血、活血化瘀之功效。现代研究表明其具有苷类、鞣质类、多糖类等多种化学成分。作为常用大宗药材，其产地较多且市场交易量大，商品规格等级也较多。由于受多种因素的影响，原有《七十六种药材商品规格标准》(年颁布实施)中牡丹皮商品规格等级划分与现行《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)对牡丹皮药材性状规定以及当前市场等级划分现状存在较大的出入，如：《中国药典》在连丹皮性状项下做出“长5～20cm，直径0.5～1.2cm”的限定，而《七十六种药材商品规格标准》中“凤丹”和“连丹”一等品项下限定为“长6cm以上，中部围粗2.5cm以上”；又如牡丹皮传统大多按照产地、长度、直径进行商品规格等级的划分，目前市场多以抽心率的高低作为等级划分依据，而木心为非药用部位，不少等级的牡丹皮药材超出了《中国药典》非药用部位限量的要求，属于不合格品。因此，这种划分方法显然影响着药材质量。另外，各产地、各药材市场等级划分较为随意，同一药材市场的不同商户之间规格等级划分也极不统一。因此，亟待制订适应新时期市场需求的牡丹皮商品规格等级标准，以规范牡丹皮药材市场交易，引导市场优质优价，形成良性循环。
目前关于中药材商品规格等级及质量评价研究主要基于感官评价、化学评价及生物活性评价或这几种方法相结合的评价方法，以化学质量评价为主，而其中又以指标性成分的含量作为评价依据，然而指标性成分与有效成分之间的关联性不明确，且受其在植物的不同分布情况影响，难以客观反映药材质量。近年来，基于液质联用技术的代谢组学分析方法在中药材质量评价方面的优势日益突出，其一方面弥补了紫外检测器对不含不饱和键的化合物响应差的短处，另一方面，其较为灵敏，因此逐步得到广泛应用。牡丹皮商品质量研究已开展不少相关工作，多集中在不同产地、不同直径药材的几个主要的指标性成分(如丹皮酚、芍药苷)的含量比较上，而对于其他成分(如多糖)含量以及不同部位化学成分差异的系统性综合比较分析仍然值得进一步深入的研究。现代研究表明，丹皮多糖具有免疫调节、抗氧化、降血糖、降血脂等多种药理作用，且根茎类药材多糖等大分子成分所占比例较小分子成分高，也有必要开展相关比较研究。
基于此，本文在商品调查基础上，进行性状数据测量，总结当前划分的性状数据规律，并将传统性状划分与质量评价相结合，以液质联用技术为主要手段，对牡丹皮中化学成分进行系统表征，并结合PCA及OPLS-DA数据分析方法，对当前牡丹皮药材商品规格等级划分的主要因素(如产地、加工、部位、粗细等)开展了深入的定性与定量比较分析评价，以期阐明牡丹皮外观性状与内在质量的规律，为科学制订牡丹皮商品规格等级标准提供依据。
1仪器及试剂
1.1仪器
ACQUITYI-Class超高效液相色谱仪；WatersXevo-G2-SQ-TOFMS质谱系统(美国Waters公司)ACQUITYUPLCTMI-Class-QTRAP四极杆-线性子阱质谱仪(美国ABSCIEX公司，配有离子喷雾接口)；WatersACQUITYUPLC-T3-C18S色谱柱(2.1mm×mm，1.7μm，美国Waters公司)；BSAS型万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；CentrifugeD型离心机(德国Eppendorf公司)；SB--DTD型超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；PacificT-Ⅱ型超纯水仪(美国Thermo公司)；AgilentHPLC(美国安捷伦科技有限公司)；WFJ型可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。
1.2试剂
对照品有芍药苷(P)、氧化芍药苷(OP)、苯甲酰芍药苷(BP)、苯甲酰氧化芍药苷(BOP)、没食子酸甲酯(GM)、没食子酸(GA)、五没食子酰葡萄糖苷(PentaG)、丹皮酚新苷(PX)、丹皮酚原苷(PY)、丹皮酚(Paeonol)(纯度均≥98%，融诚鑫徳科技发展有限公司)；D-葡萄糖(99.9%，中国食品药品检定研究院，批号为-)；蒽酮(分析纯，含量98%，国药集团化学试剂有限公司，批号为)；硫酸(分析纯，含量95%～98%，北京化工厂，批号为)。水为超纯水、甲醇，乙腈为色谱纯(美国FisherScientific公司)，其余试剂均为分析纯。
2实验内容
2.1商品调查
年4月至年11月，课题组成员先后实地走访了安徽亳州、铜陵及重庆垫江几个牡丹皮主产区，到田间地头实地查看牡丹皮的田间管理和采收情况，同时到多户药材收购商(家庭小作坊式)存放牡丹皮药材的库房查看牡丹皮的初加工、储藏和规格等级划分情况，并先后赴安徽亳州、河北安国、四川荷花池及广西玉林等各大药材市场，对牡丹皮药材进行市场流通情况调查。
2.2外观性状数据测量
对产区或药材市场随机进行多点取样，收集不同农户或商户各规格等级牡丹皮药材，并对其进行性状数据测量，每份样品随机取10个个体并用游标卡尺测量牡丹皮药材最粗处外径、内径、皮部厚度，用直尺测量牡丹皮药材的长度，用天平测量每个个体的质量。
2.3UPLC-Q-TOF-MS分析
该部分内容参见本课题组相关研究。
2.4UPLC-Q-Trap-MS-MS分析
该部分内容参见本课题组相关研究。
2.5丹皮酚含量测定
丹皮酚含量测定方法参照《中国药典》牡丹皮项下丹皮酚的含量测定方法。
2.6多糖含量测定
多糖含量测定方法见本课题组相关研究。
3实验结果
3.1商品调查
牡丹皮为常用大宗药材，用量较大，产区较多(如安徽、重庆、河南、山东、陕西等省、直辖市均有栽培)，当前主产区为安徽亳州。据本次产地及市场调查、走访大户等方式了解到当前亳州产牡丹皮至少占全国牡丹皮产量的50%以上。此外，传统以安徽铜陵等地最为知名，习称“凤丹皮”，重庆垫江丹皮亦较知名，两者传统奉为道地。而其他产地牡丹皮产量较少。产地加工是药材商品规格等级形成的源头，因此本研究对药材主产区和传统道地产区(亳州、铜陵、垫江)做了产地调查，对各产区的产地加工分级做了归纳总结。在此基础上，对国内几个大型药材市场做了市场商品调查。
3.1.1产地调查亳州产区牡丹皮按照产地加工方法的不同分为“连丹皮”(因牡丹皮栓皮颜色较深，故不刮皮者又称“黑丹皮”)和“刮丹皮”。抖净泥土后，直接人工去心，或机器开缝去心者，称为“连丹皮”。趁鲜刮去外皮再去心者，称为“刮丹皮”。去除木心后，再人工拣选，一般较大者为大选货，较小者为小选货，或者不分大小，称为统货。此外，其产地加工中尚存在熏硫的现象。目前各药材市场所见牡丹皮多数为亳州产牡丹皮。铜陵产区牡丹皮以人工去心方法为主。采挖根部，抖净泥土带回，略晾晒或不晾晒，剪下根条，直接剥取根皮，较粗壮，无法剥者，用小锤轻锤，至皮破后，再剥取牡丹皮。按直径及品相分为不同的等级，最粗者称为“一条”，次粗者称“二条”，最细者称“三条”；另外还挑选条匀直、皮细、长度约5～8cm、中部围粗0.6～1cm者，称为“标二条”，为最贵的一种等级，据多家收购商介绍，专供出口；极细无法抽去木心者称为“尾根”(不符合《中国药典》标准)；靠近地上部分者，品相差，易碎，称为“大头壳”(不符合《中国药典》标准)。分级后分别晾晒至干燥。铜陵产牡丹皮一般不去皮，不熏硫，多为晒干或阴干，抽心率几乎可以达到%，杂质也较少，一般认为品质较好。除在铜陵本地小型收购户见到铜陵丹皮，在国内各大药材市场均少见。因此，本次标准制订中，铜陵产牡丹皮规格等级划分以在铜陵本地采集样品为基础。垫江牡丹皮加工去心均为人工去心，加工方法基本一致。一般按照加工方法分为“连丹皮”和“刮丹皮”，“连丹皮”和“刮丹皮”规格下，又按照直径分为选货和统货。因目前垫江药用牡丹皮的种植受观赏牡丹高利润的冲击，产量逐年下降，商品量较少，除了在重庆解放路药材专业市场及荷花池药材市场见过少量出售，其他药材市场均未见垫江牡丹皮商品。因此，本次牡丹皮药材商品规格等级标准制订时未将“川丹皮”单列为一个规格。
3.1.2市场调查市场所见牡丹皮药材主要为安徽亳州产牡丹皮，西南地区市场尚有垫江丹皮规格，依据加工方法，分为“连丹皮”和“刮丹皮”。除此以外，市场上尚存在较多熏硫丹皮，熏硫丹皮通体色白，有酸味。市场上牡丹皮药材主要依据牡丹皮直径大小、抽心率、含杂率等划分为大选货、小选货、大统货、小统货和统货。不同药材市场，不同商户间对不同等级的牡丹皮的称呼有所不同；除牡丹皮药材外，尚有牡丹皮切制成片的形式，分级亦根据大小、抽心率、杂质含量等，有大选片、小选片、大统片、小统片、统片等。
3.1.3小结根据产地及市场调查，牡丹皮药材当前划分商品规格等级的主要方法为：根据产地不同划分规格，再根据去皮与否分成“连丹皮”与“刮丹皮”两个规格，各规格下根据药材长度、直径以及抽心率做等级划分。市场流通过程中牡丹皮药材规格等级划分详见表1，且市场上一般认为长度越长、直径越大、抽芯率越高，其质量越好，价格越高。
3.2性状数据分析
根据以上研究结果，牡丹皮药材品质受产地影响因素较少，而“凤丹皮”因传统奉为道地，单独设为一个规格，其他产地归并。产地规格下根据去皮与否分为“连丹皮”与“刮丹皮”，抽心率应严格控制在《中国药典》限定值内。而等级则根据性状进行划分，本研究对所取样品的长度、外径、内径、皮部厚度、个体重量分别作了测量并进行了统计分析，提取核心划分指标，以便于市场操作。
结果表明，不同等级的牡丹皮药材的长度为6.9～20.3cm，均值为11.2cm；外径0.37～1.38cm，均值为0.92cm；内径为0.11～0.8cm，均值为0.44cm；皮部厚度为0.16～0.36cm，均值为0.28cm；个体质量为1.2～17.5g，均值为5.8g。《中国药典》规定连丹皮药材长5～20cm，直径0.5～1.2cm，厚0.1～0.4cm。基本符合《中国药典》外观性状要求。
因每家每户划分稍有差异，称呼不同，因此先用Excel表格对各测量量的最大值、最小值及均值进行粗略统计，将样品性状测定值差异不大的归为一类(因市场上牡丹皮等级的划分主要依据其外径大小，故归并时以外径的均值作为主要归并的依据)，再用SPSS12.0软件进行相关数据分析。
3.2.1铜陵牡丹皮性状数据处理利用SPSS12.0软件，对所有直径与长度的数据进行非参数的K-S检验，发现长度、外径、内径、皮部厚度的P0.05(见表2)，说明测定数据符合正态分布。将所有铜陵产不同等级的牡丹皮药材的长度、外径、内径、皮部厚度及个体质量的测定数据进行单样本T检验，设置置信区间百分比为99%，计算不同等级牡丹皮的长度、外径、内径、皮部厚度的上限和下限(统一置信水平，避免主观因素的影响，结果见表3)。由置信区间计算出的各规格等级性状数据分布范围如表3所示。
综合考虑牡丹皮药材的长度、外径、皮部厚度、内径的数值及对牡丹皮药材等级划分的影响，将4个因素的权重设定为：外径长度皮部厚度内径。
3.2.2其他产地牡丹皮药材性状数据测定及数据分析其他产地牡丹皮药材性状数据测定及数据处理方法同铜陵牡丹皮。单样本Kolmogorov-Smirnov检验结果见表4，由置信区间计算出的各等级性状数据分布范围如表5所示。
牡丹皮药材商品规格等级的划分以长度和外径为主要划分因素，数据分析结果表明：铜陵一等长度为11.3～13.3cm，外径为10.59～12.03mm；铜陵二条的长度为9.03～10.91cm，外径为9.04～11.01mm；铜陵三条的长度为7.38～9.14cm，外径为5.09～5.92mm；铜陵标二条的长度为9.36～11.06cm，外径为7.20～8.26mm。其他产地大选货长度为13.05～15.21cm，外径为12.60～14.15mm；小选货长度为9.57～11.16cm，外径为10.00～10.83cm；统货长度为7.90～9.18cm，外径为7.11～7.86mm。
3.2.3小结性状划分中，不同因素权重为：外径长度皮部厚度内径，由于内部直径与皮部厚度受不同部位测定差异较大，且不好操作，因此选择长度与直径作为性状划分依据。
3.3不同产地牡丹皮差异成分研究
牡丹皮药材市场有根据产地分规格的情况，传统有分“凤丹皮”“瑶丹皮”“川丹皮”等，然仅靠性状较难准确区分，因此存在各地混杂的情况，然而各产区之间所产牡丹皮是否存在较大质量差异，是否有必要按照产区划分规格，尚需进一步的研究，基于此，本研究对亳州、铜陵及垫江3个代表性产区进行取样并对其内在成分做了系统的定性与定量比较分析，为产地规格的制订提供依据。
3.3.1实验材料来源鲜牡丹皮样品：年8月至9月本文作者于垫江、亳州及铜陵采集4年生牡丹样品各10株，趁鲜去除木心，于30℃烘干(48h)，备用。打粉，粉末过《中国药典》3号筛，备用。牡丹皮药材：年4月至年11月从各产地采集的牡丹皮药材。粉碎，粉末过《中国药典》3号筛，备用。
3.3.2不同产地牡丹皮次生代谢产物差异分析牡丹皮中主要化学成分的结构通过质谱进行推测，在总结对照品裂解规律的基础上，根据色谱峰保留时间、质谱碎片结合裂解规律及相关文献资料进行结构推测。对供试品进行UPLC-Q-TOF-MS分析，将数据导入Masslynx4.1软件中自带的数据库以及Chemspider(
